আরটিএল রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ
আরটিএল রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ হল একটি আরএনএ টেমপ্লেট-নির্ভর ডিএনএ পলিমারেজ যাতে 3'→5' এক্সোনুক্লিজ অ্যাক্টিভিটি নেই এবং RNase H কার্যকলাপ রয়েছে।এই এনজাইমটি DNA-এর একটি পরিপূরক স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণ করতে একটি টেমপ্লেট হিসাবে RNA ব্যবহার করতে পারে, যা প্রথম-স্ট্র্যান্ড cDNA সংশ্লেষণে প্রয়োগ করা যেতে পারে, বিশেষ করে RT-LAMP (লুপ-মিডিয়াটেড আইসোথার্মাল অ্যামপ্লিফিকেশন) এর জন্য।RTL রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ 1.0 এর সাথে তুলনা করে, সংবেদনশীলতা উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত, তাপীয় স্থিতিশীলতা শক্তিশালী এবং 65°C এ প্রতিক্রিয়া আরও স্থিতিশীল।RTL রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস (গ্লিসারল মুক্ত) লাইওফিলাইজড প্রস্তুতি, লাইওফিলাইজড RT-LAMP রিএজেন্ট ইত্যাদি প্রস্তুত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।
ইউনিট সংজ্ঞা
একটি ইউনিট পলি(A)•oligo(dT)25কে টেমপ্লেট-প্রাইমার হিসাবে ব্যবহার করে 50°C তাপমাত্রায় 20 মিনিটে অ্যাসিড-প্রক্ষেপণযোগ্য উপাদানে 1 nmol dTTP অন্তর্ভুক্ত করে।
উপাদান
| উপাদান | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস (গ্লিসারল-মুক্ত) (15U/μL) | 0.1 মিলি | 1 মি.লি | 10 মিলি |
| 10×HC RTL বাফার | 1.5 মি.লি | 4×1.5 মিলি | 5×10 মিলি |
| MgSO4 (100 মিমি) | 1.5 মি.লি | 2×1.5 মিলি | 3×10 মিলি |
স্টোরেজ কন্ডিশন
0°C এর নিচে পরিবহন এবং -25°C~-15°C এ সংরক্ষণ করা হবে।
মান নিয়ন্ত্রণ
- এর অবশিষ্ট কার্যকলাপEndonuclease:একটি 50 μL বিক্রিয়া যাতে 1 μg λDNA এবং 15 ইউনিট RTL2.0 37 ℃ এ 16 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয় জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণের মতো একই প্যাটার্ন দেখায়।
- এর অবশিষ্ট কার্যকলাপExonuclease:একটি 50 μL বিক্রিয়া যাতে 1 μg হিন্দ Ⅲ হজম করা λDNA এবং RTL2.0 এর 15 ইউনিট 37 ℃ তাপমাত্রায় 16 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয় জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণের মতো একই প্যাটার্ন দেখায়।
- এর অবশিষ্ট কার্যকলাপনিকসে:একটি 50 μL বিক্রিয়া যাতে 1 μg সুপারকোয়েলড pBR322 এবং RTL2.0 এর 15 ইউনিট 37°C তাপমাত্রায় 4 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয় জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণের মতো একই প্যাটার্ন দেখায়।
- এর অবশিষ্ট কার্যকলাপRNase:একটি 10 μL বিক্রিয়া যাতে 0.48 μg MS2 RNA এবং 15 ইউনিট RTL2.0 37°C তাপমাত্রায় 4 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয় জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণের মতো একই প্যাটার্ন দেখায়।
- ই কোলাই gডিএনএ:দিয়ে পরিমাপ করা হয়ই কোলাইনির্দিষ্ট এইচসিডি সনাক্তকরণ কিট，RTL2.0 এর 15 ইউনিটে 1 এর কম থাকেই কোলাইজিনোম
প্রতিক্রিয়া সেটআপ
cDNA সংশ্লেষণ প্রোটোকল
| উপাদান | আয়তন |
| টেমপ্লেট RNA a | ঐচ্ছিক |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) বা র্যান্ডম প্রাইমার মিক্স (60uM) | 2 μL |
| dNTP মিক্স (10 মিমি প্রতিটি) | 1 μL |
| RNase ইনহিবিটার (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL বাফার | 2 μL |
| নিউক্লিয়াস-মুক্ত জল | 20 μL পর্যন্ত |
মন্তব্য:
1) মোট RNA এর প্রস্তাবিত ডোজ হল 1ng~1μg
2) mRNA এর প্রস্তাবিত ডোজ ছিল 50ng~100ng
থার্মো-একটি রুটিন জন্য সাইক্লিং শর্তাবলী প্রতিক্রিয়া:
| তাপমাত্রা (°সে) | সময় |
| 25 °সেa | 5 মিনিট |
| 55 °সে | 10 মিনিটb |
| 80°সে | 10 মিনিট |
মন্তব্য:
1) যদি র্যান্ডম প্রাইমার মিক্স ব্যবহার করা হয়, 25°C তাপমাত্রায় একটি ইনকিউবেশন স্টেপ।
2) টার্গেট প্রাইমার মিক্স ব্যবহার করা হলে, 10~30 মিনিটের জন্য 55°C তাপমাত্রায় একটি ইনকিউবেশন স্টেপ।
RT-LAMP প্রোটোকল
| উপাদান | আয়তন | চূড়ান্ত ঘনত্ব |
| টেমপ্লেট RNA | ঐচ্ছিক | ≥10 কপি |
| dNTP মিক্স (10 মিমি) | 3.5 μL | 1.4 মিমি |
| FIP/BIP প্রাইমার (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 প্রাইমার (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| লুপএফ/লুপবি প্রাইমার (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase ইনহিবিটার (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/প্রতিক্রিয়া |
| RTL রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 ইউ/প্রতিক্রিয়া |
| Bst V2 DNA পলিমারেজ (8U/μL) | 1 μL | 8 ইউ/প্রতিক্রিয়া |
| MgSO4 (100 মিমি) | 1.5 μL | 6 মিমি (মোট 8 মিমি) |
| 10×HC RTL বাফার (বা 10×HC Bst V2 বাফার) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| নিউক্লিয়াস-মুক্ত জল | 25 μL পর্যন্ত | - |
মন্তব্য:
1) সংক্ষিপ্তভাবে সংগ্রহ করতে ঘূর্ণি এবং সেন্ট্রিফিউজ দ্বারা মিশ্রিত করুন।1 ঘন্টার জন্য 65 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ধ্রুবক ইনকিউবেশন।
2) দুটি বাফার ইন্টারঅপারেবল এবং একই রচনা রয়েছে।
মন্তব্য
1. -20 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সংরক্ষণ করা হলে এই পণ্যটি একটি সাদা কঠিন গঠন করবে।এটিকে -20 ডিগ্রি সেলসিয়াস থেকে বের করে প্রায় 10 মিনিটের জন্য বরফের উপর রাখুন।গলে যাওয়ার পরে, এটি ঝাঁকিয়ে এবং মিশ্রিত করে ব্যবহার করা যেতে পারে।
2. cDNA পণ্যটি -20°C বা -80°C এ সংরক্ষণ করা যেতে পারে বা PCR প্রতিক্রিয়ার জন্য অবিলম্বে ব্যবহার করা যেতে পারে।
3. RNase দূষণ রোধ করতে, অনুগ্রহ করে পরীক্ষামূলক এলাকা পরিষ্কার রাখুন এবং অপারেশনের সময় পরিষ্কার গ্লাভস এবং মাস্ক পরিধান করুন।
