প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট পিসিআর কিট

বিড়াল নম্বর: HCR2020A

প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট পিসিআর কিট উদ্ভিদের পাতা, বীজ ইত্যাদির সরাসরি পরিবর্ধনের জন্য উপযুক্ত, এবং পলিস্যাকারাইড এবং পলিফেনল ধারণ করে না এমন উদ্ভিদের নমুনাগুলির উচ্চ-থ্রুপুট স্ক্রীনিংয়ের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।নির্দেশিত বিবর্তনের উপর ভিত্তি করে প্রত্যক্ষ পরিবর্ধন ডিএনএ পলিমারেজের উদ্ভিদে পিসিআর ইনহিবিটরদের উচ্চতর সহনশীলতা রয়েছে।এদিকে, এটি উচ্চ পরিবর্ধন কর্মক্ষমতা বজায় রাখে, যা 5 kb-এর মধ্যে DNA খণ্ডের পরিবর্ধনের জন্য উপযুক্ত।কিটের অনন্য লাইসিস বাফার A তাজা বা হিমায়িত উদ্ভিদ টিস্যু লাইজ করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।এটি পরিচালনা করা সহজ এবং লাইসেট পরিশোধন ছাড়াই পরিবর্ধনের জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।সিস্টেমে প্রতিরক্ষামূলক এজেন্ট রয়েছে যা অপরিশোধিত নমুনাগুলিকে বারবার হিমায়িত এবং গলানোর পরে কার্যকরভাবে প্রসারিত করতে সক্ষম করে।2 × প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট মাস্টার মিক্সকে শুধুমাত্র অ্যামপ্লিফিকেশন রিঅ্যাকশন সঞ্চালনের জন্য প্রাইমার এবং টেমপ্লেট যোগ করতে হবে, যার ফলে পাইপটিং অপারেশন কমানো যায় এবং ফলাফলের সনাক্তকরণ থ্রুপুট এবং প্রজননযোগ্যতা উন্নত হয়।

উপাদান

*প্লান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার বি হল একটি ঐচ্ছিক বিকারক, যা নমুনার স্টোরেজ সময়কে দীর্ঘায়িত করার জন্য প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার A কে নিরপেক্ষ করতে ব্যবহৃত হয়।এটি বাস্তব পরিস্থিতি অনুযায়ী ব্যবহার করা যেতে পারে।

জমা শর্ত

2 × প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট মাস্টার মিক্স, -30 ~ -15℃ এ সংরক্ষণ করুন এবং বারবার জমাট বাঁধা এবং গলানো এড়ান;প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার, -30 ~ -15℃ বা 2 ~ 8℃ এ স্টোর করুন।

পরীক্ষা প্রক্রিয়া

নমুনা প্রক্রিয়াকরণ-উদ্ভিদ পাতা

সরাসরি পদ্ধতি:তরুণ পাতা ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।একটি ছোট এবং অভিন্ন নমুনা পেতে 0.5 - 3 মিমি একটি নির্দিষ্ট ব্যাস সহ একটি হোল পাঞ্চ ব্যবহার করুন এবং তারপরে সরাসরি PCR সিস্টেমে নমুনা যোগ করুন (50 μl সিস্টেম সুপারিশ করা হয়)।দ্রষ্টব্য, নিশ্চিত করুন যে নমুনাটি পিসিআর দ্রবণে রয়েছে এবং টিউবের প্রাচীরের বিপরীতে নয়।লম্বা টুকরো এবং জটিল নমুনাগুলিকে প্রসারিত করতে যদি সরাসরি পিসিআর ব্যবহার করা হয়, একটি টেমপ্লেট হিসাবে একটি ছোট ব্যাস (0.5 - 1 মিমি) সহ একটি নমুনা ব্যবহার করা ভাল ফলাফল পেতে সাহায্য করতে পারে।

গ্রাইন্ডিং লাইসিস পদ্ধতি:তরুণ পাতা ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।পাতার একটি ছোট টুকরো নিন (প্রায় 1 - 3 মিমি ব্যাস), এটিকে 20 μl প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার অ্যাবে রাখুন এবং যতটা সম্ভব পিষুন (এই ধাপটি 100 μl পিপেটের ডগা দিয়ে পাতাটি চেপে ধরে করা যেতে পারে। নমুনা ম্যাশ করতে)।যদি পাতার টিস্যুগুলির বৃহত্তর পরিমাণ ব্যবহার করা হয় (7 মিলিমিটারের বেশি না হয়), পাতলা বাফারের আয়তন 50 μl এ বৃদ্ধি করুন।পাতা মাটি হয়ে যাওয়ার পরে, সমাধানটি সবুজ দেখাতে হবে।একটি সংক্ষিপ্ত সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, প্রতিক্রিয়া টেমপ্লেট হিসাবে পিসিআর সিস্টেমে সুপারনাট্যান্টের 1 μl যোগ করুন।

থার্মাল লাইসিস পদ্ধতি:তরুণ পাতা ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।পাতার একটি ছোট টুকরো নিন (প্রায় 1 - 3 মিমি ব্যাস), এটি 20 μl প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার A-তে রাখুন এবং 5 - 10 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে গরম করুন।লাইসিস সময় যথাযথভাবে বাড়ানো যেতে পারে এমন পাতার জন্য যেগুলি লিজ করা কঠিন (20 মিনিটের বেশি নয়)।যদি পাতার টিস্যুগুলির বৃহত্তর পরিমাণ ব্যবহার করা হয় (7 মিলিমিটারের বেশি না হয়), পাতলা বাফারের আয়তন 50 μl এ বৃদ্ধি করুন।গরম করার পরে, সংক্ষিপ্তভাবে সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং প্রতিক্রিয়া টেমপ্লেট হিসাবে PCR সিস্টেমে 1 μl সুপারনাট্যান্ট যোগ করুন।

নমুনা প্রক্রিয়াকরণ- বীজ রোপণ

গ্রাইন্ডিং লাইসিস পদ্ধতি:5 মিমি ব্যাসের বীজ কাটার জন্য একটি স্ক্যাল্পেল ব্যবহার করুন, সেগুলিকে 100 μl প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার এ যোগ করুন এবং নমুনাটি পিপেটের ডগা বা অন্যান্য সরঞ্জাম দিয়ে পিষুন।ঘূর্ণি সংক্ষেপে এবং ঘরের তাপমাত্রায় 3 - 5 মিনিটের জন্য দাঁড়াতে দিন।নিশ্চিত করুন যে বীজের নমুনাটি পাতলা বাফারে নিমজ্জিত হয়েছে।একটি সংক্ষিপ্ত সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, প্রতিক্রিয়া টেমপ্লেট হিসাবে পিসিআর সিস্টেমে সুপারনাট্যান্টের 1 μl যোগ করুন।

থার্মাল লাইসিস পদ্ধতি:5 মিমি ব্যাসের বীজ কাটার জন্য একটি স্ক্যাল্পেল ব্যবহার করুন, সেগুলিকে 100 μl প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার A-তে যোগ করুন এবং 5 - 10 মিনিটের জন্য 95°C তাপমাত্রায় তাপ করুন৷লাইসিস সময় যথাযথভাবে বাড়ানো যেতে পারে এমন পাতার জন্য যেগুলি লিজ করা কঠিন (30 মিনিটের বেশি নয়)।গরম করার পরে, সংক্ষিপ্তভাবে সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং প্রতিক্রিয়া টেমপ্লেট হিসাবে PCR সিস্টেমে 1 μl সুপারনাট্যান্ট যোগ করুন।

ককাঁচি বা অন্যান্য সরঞ্জামও উপযুক্ত আকারের নমুনা কাটতে ব্যবহার করা যেতে পারে;যদি পাঞ্চ বা কাঁচি পুনরায় ব্যবহার করা হয়, তাহলে নমুনার মধ্যে ক্রস-দূষণ রোধ করতে প্রতিটি ব্যবহারের আগে 2% সোডিয়াম হাইপোক্লোরাইট দ্রবণ দিয়ে পরিষ্কার করা উচিত।

খ.নিশ্চিত করুন যে প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফারটি ব্যবহারের আগে সম্পূর্ণরূপে গলে গেছে।যদি বাফারটি সান্দ্র হয় বা অবক্ষয় থাকে, তবে ব্যবহারের আগে এটি সম্পূর্ণরূপে গলে যাওয়ার জন্য এটি 37℃ এ গরম করা যেতে পারে।

গ.বিক্রিয়া পদ্ধতিতে টেমপ্লেটের ভলিউম উদ্ভিদ উপাদান এবং যোগ করা তরল পদার্থের আয়তনের পার্থক্য অনুসারে যথাযথভাবে সামঞ্জস্য করা যেতে পারে।

প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার

এই পণ্যটিতে থাকা প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার Aকে বেশিরভাগ উদ্ভিদের টিস্যুর জিনোম মুক্তি দেওয়ার জন্য কঠোরভাবে অপ্টিমাইজ করা হয়েছে এবং 4℃ এ অপরিশোধিত উদ্ভিদের স্বল্পমেয়াদী স্টোরেজের জন্য উপযুক্ত।যদি নমুনাটি দীর্ঘ সময়ের জন্য সংরক্ষণ করার প্রয়োজন হয় (যেমন, 1 - 2 মাস), তাহলে সুপারনাট্যান্টটিকে একটি নতুন EP টিউবে স্থানান্তরিত করার এবং -20℃-এ সংরক্ষণ করার পরামর্শ দেওয়া হয়।নমুনাগুলিকে আরও স্থিরভাবে সংরক্ষণ করতে, স্থানান্তরিত সুপারন্যাট্যান্টে সমান পরিমাণ প্ল্যান্ট ডাইরেক্ট লাইসিস বাফার বি যোগ করুন, ভালভাবে মেশান এবং -20℃ এ সংরক্ষণ করুন।স্থিতিশীল স্টোরেজ সময় উদ্ভিদ নমুনা এবং রাজ্যের সাথে পরিবর্তিত হয়।

প্রতিক্রিয়া সিস্টেম

কএতে Mg থাকে²⁺2 মিমি চূড়ান্ত ঘনত্বে।

খ.প্রতিটি প্রাইমারের জন্য 0.4μM এর চূড়ান্ত ঘনত্ব ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।প্রাইমারের অত্যধিক ব্যবহার অনির্দিষ্ট পরিবর্ধন বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করবে।

গ.ব্যবহৃত নমুনার পরিমাণ প্রকৃত পরিস্থিতি অনুযায়ী সামঞ্জস্য করা যেতে পারে।অপরিশোধিত লাইজড নমুনার একক বিক্রিয়ায় ব্যবহৃত পরিমাণ বিক্রিয়ার মোট আয়তনের 2% - 20% এর মধ্যে সমন্বয় করা যেতে পারে।অত্যধিক নমুনা ব্যবহার করে পরিবর্ধন ব্যর্থতা হতে পারে।

প্রতিক্রিয়া প্রোগ্রাম

কপ্রাথমিক ডিনাচুরেশন (98℃, 5 মিনিট) উদ্ভিদ টিস্যুর লাইসিসকে উৎসাহিত করে, জিনোমিক ডিএনএ মুক্ত করে যা পিসিআর পরিবর্ধনের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।সময় কমানো বা তাপমাত্রা হ্রাস করবেন না।

খ.এটি প্রাইমার Tm মানের সমান বা Tm মানের থেকে 2 ~ 4℃ বেশি সেট করার পরামর্শ দেওয়া হয়।এই পণ্যটিতে ব্যবহৃত সরাসরি পরিবর্ধন ডিএনএ পলিমারেজ প্রচলিত Taq ডিএনএ পলিমারেজ থেকে আলাদা, এবং প্রতিক্রিয়া অ্যানিলিং তাপমাত্রার জন্য বিশেষ প্রয়োজনীয়তা রয়েছে; উচ্চ অ্যানিলিং তাপমাত্রার ব্যবহার কার্যকরভাবে অনির্দিষ্ট পরিবর্ধন হ্রাস করতে পারে এবং পরিবর্ধন দক্ষতা উন্নত করতে পারে।জটিল টেমপ্লেটগুলির জন্য, অ্যানিলিং তাপমাত্রা সামঞ্জস্য করে এবং এক্সটেনশন সময় দীর্ঘায়িত করে দক্ষ পরিবর্ধন অর্জন করা যেতে পারে।

গ.যদি পরিবর্ধন পণ্যের দৈর্ঘ্য ≤1 kb হয়, এক্সটেনশন সময় 30 সেকেন্ড/কেবি সেট করা হয়;যদি পরিবর্ধন পণ্যের দৈর্ঘ্য >1 kb হয়, এক্সটেনশন সময় 60 সেকেন্ড/kb এ সেট করা হয়।

dজটিল নমুনা বা কম পরিবর্ধন ফলন সহ নমুনার জন্য, চক্রের সংখ্যা যথাযথভাবে 40 -50 চক্রে বাড়ানো যেতে পারে।

অ্যাপ্লিকেশন

এটি উদ্ভিদের টিস্যুগুলির প্রত্যক্ষ পরিবর্ধন এবং পলিস্যাকারাইড এবং পলিফেনল ধারণ করে না এমন উদ্ভিদ নমুনার উচ্চ-থ্রুপুট স্ক্রীনিংয়ের জন্য প্রযোজ্য।

মন্তব্য

শুধুমাত্র গবেষণা ব্যবহারের জন্য।ডায়াগনস্টিক পদ্ধতিতে ব্যবহারের জন্য নয়।

1. অপরিশোধিত উদ্ভিদ পরিবর্ধন বা সরাসরি পরিবর্ধনের জন্য, সিস্টেম, প্রাইমার এবং অপারেশনগুলি সঠিক কিনা তা নিশ্চিত করার জন্য পরীক্ষা শুরু করার আগে একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে বিশুদ্ধ জিনোমিক ডিএনএ ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

2. এই কিটে ব্যবহৃত সরাসরি পরিবর্ধন ডিএনএ পলিমারেজের শক্তিশালী প্রুফরিডিং কার্যকলাপ রয়েছে।যদি টিএ ক্লোনিং সঞ্চালনের প্রয়োজন হয়, তাহলে অ্যাডেনিন যোগ করার আগে ডিএনএ শুদ্ধ করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

3. প্রাইমার ডিজাইন গাইডেন্স:

কএটি সুপারিশ করা হয় যে প্রাইমারের 3′ শেষে শেষ বেসটি G বা C হওয়া উচিত।

খ.প্রাইমারের 3′ শেষে শেষ 8টি ঘাঁটিতে পরপর অমিলগুলি এড়ানো উচিত।গ.প্রাইমারের 3′ প্রান্তে হেয়ারপিন স্ট্রাকচার এড়িয়ে চলুন।

dফরোয়ার্ড প্রাইমার এবং রিভার্স প্রাইমারের Tm মানের মধ্যে পার্থক্য 1℃ এর বেশি হওয়া উচিত নয় এবং Tm মান 60 ~ 72℃ এ সামঞ্জস্য করা উচিত (Tm মান গণনা করার জন্য প্রাইমার প্রিমিয়ার 5 সুপারিশ করা হয়)।

eপ্রাইমারের Tm মান গণনা করার সময় অতিরিক্ত অতিরিক্ত প্রাইমার সিকোয়েন্স যা টেমপ্লেটের সাথে মেলে না, অন্তর্ভুক্ত করা উচিত নয়।

চপ্রাইমারের GC বিষয়বস্তু 40% -60% হওয়া বাঞ্ছনীয়।

gপ্রাইমারে A, G, C এবং T এর সামগ্রিক বন্টন যতটা সম্ভব সমান হওয়া উচিত।উচ্চ GC বা AT সামগ্রী সহ অঞ্চলগুলি ব্যবহার করা এড়িয়ে চলুন।

জ.প্রাইমারের মধ্যে বা দুটি প্রাইমারের মধ্যে 5 বা ততোধিক ঘাঁটির পরিপূরক অনুক্রমের উপস্থিতি এড়িয়ে চলুন এবং দুটি প্রাইমারের 3′ প্রান্তে 3 বা তার বেশি বেসের পরিপূরক অনুক্রমের উপস্থিতি এড়িয়ে চলুন।

iঅনির্দিষ্ট পরিবর্ধন রোধ করতে প্রাইমারের নির্দিষ্টতা পরীক্ষা করতে NCBI BLAST ফাংশন ব্যবহার করুন।