হটস্টার্ট তাক ডিএনএ পলিমারেজ
হট স্টার্ট টাক ডিএনএ পলিমারেজ (অ্যান্টিবডি পরিবর্তন) হল থার্মাস অ্যাকুয়াটিকাস YT-1 থেকে একটি হট-স্টার্ট থার্মোস্টেবল ডিএনএ পলিমারেজ, যা একটি 5′→3′ পলিমারেজ কার্যকলাপ এবং একটি 5' ফ্ল্যাপ এন্ডোনিউক্লিজ কার্যকলাপের অধিকারী।হট-স্টার্ট Taq DNA পলিমারেজ হল একটি Taq DNA পলিমারেজ যা থার্মোলাবিল Taq অ্যান্টিবডি দ্বারা পরিবর্তিত হয়।অ্যান্টিবডি পরিবর্তনের ফলে পিসিআর-এর সুনির্দিষ্টতা, সংবেদনশীলতা এবং ফলন বেড়েছে।
উপাদান
| উপাদান | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq বাফার | 4×1 মিলি | 4×10 মিলি | 4×50 মিলি | 5×400 মিলি |
| হট স্টার্ট Taq DNA পলিমারেজ (অ্যান্টিবডি পরিবর্তিত) (5 U/μL) | 0.1 মিলি | 1 মি.লি | 5 মি.লি | 10×5 মিলি |
অ্যাপ্লিকেশন
10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 25℃), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPALCA-630 এবং 50% গ্লিসারল।
স্টোরেজ কন্ডিশন
0°C এর নিচে পরিবহন এবং -25°C~-15°C এ সংরক্ষণ করা হবে।
ইউনিট সংজ্ঞা
এক ইউনিটকে 75°C তাপমাত্রায় 30 মিনিটে অ্যাসিড অদ্রবণীয় পদার্থে 15 nmol dNTP এনজাইমের পরিমাণ হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়।
মান নিয়ন্ত্রণ
1.Endonuclease কার্যকলাপ:4 μg pUC19 DNA সহ 20 U এনজাইম 37 ℃ তাপমাত্রায় 4 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেশনের ফলে জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত ডিএনএর কোন শনাক্তযোগ্য অবক্ষয় ঘটেনি।
2.5 kb Lambda PCR:200 µM dNTPs এবং 0.2 µM প্রাইমারের উপস্থিতিতে Taq DNA পলিমারেজের 1.25 ইউনিট সহ 5 ng Lambda DNA-এর PCR পরিবর্ধনের 25 চক্র প্রত্যাশিত 5 kb পণ্যের ফলাফল।
3.Exonuclease কার্যকলাপ:50 μl বিক্রিয়ায় ন্যূনতম 12.5 U Taq DNA পলিমারেজ 10 nmol 5´-FAM অলিগোনিউক্লিওটাইড সহ 30 মিনিটের জন্য 37℃-এ ইনকিউবেশন করলে কোন সনাক্তকরণযোগ্য অবক্ষয় পাওয়া যায় না।
4.RNase কার্যকলাপ:37°C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য 1μg RNA ট্রান্সক্রিপ্টের সাথে 20 U এনজাইম ধারণকারী 10 μL বিক্রিয়ার ইনকিউবেশনের ফলে জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত RNA-এর কোন শনাক্তযোগ্য অবক্ষয় ঘটেনি।
5.তাপ নিষ্ক্রিয়করণ:না.
প্রতিক্রিয়া সিস্টেম
| উপাদান | আয়তন |
| টেমপ্লেট ডিএনএa | ঐচ্ছিক |
| 10 μM ফরোয়ার্ড প্রাইমার | 0.5 μL |
| 10 μM বিপরীত প্রাইমার | 0.5 μL |
| dNTP মিক্স (10 মিমি প্রতিটি) | 0.5 μL |
| 5×HC Taq বাফার | 5 μL |
| তাক ডিএনএ পলিমারেজখ(5U/μL) | 0.125 μL |
| নিউক্লিয়াস-মুক্ত জল | 25 μL পর্যন্ত |
মন্তব্য:
1) ক.
| ডিএনএ | পরিমাণ |
| জিনোমিক | 1 ng-1 μg |
| প্লাজমিড বা ভাইরাল | 1 pg-1 ng |
2) খ.Taq DNA পলিমারেজের সর্বোত্তম ঘনত্ব বিশেষায়িত অ্যাপ্লিকেশনে 5-50 ইউনিট/mL (0.1-0.5 ইউনিট/25 μL প্রতিক্রিয়া) হতে পারে।
থার্মাল সাইক্লিং প্রোটোকল
পিসিআর
| ধাপ | তাপমাত্রা(°সে) | সময় | চক্র |
| প্রাথমিক বিকৃতকরণa | 95 ℃ | 1-3 মিনিট | - |
| বিকৃতকরণ | 95 ℃ | 15-30 সেকেন্ড | 30-35 সাইকেল |
| অ্যানিলিংখ | 45-68 ℃ | 15-60 সেকেন্ড | |
| এক্সটেনশন | 68 ℃ | 1kb/মিনিট | |
| চূড়ান্ত এক্সটেনশন | 68 ℃ | 5 মিনিট | - |
মন্তব্য:
1) 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 1 মিনিটের একটি প্রাথমিক বিকৃতকরণ বেশিরভাগ পরিবর্ধনের জন্য যথেষ্ট।কঠিন টেমপ্লেটগুলির জন্য, 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 2-3 মিনিটের দীর্ঘ বিকৃতকরণ বাঞ্ছনীয়।কলোনি পিসিআর-এর সাথে, 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে প্রাথমিক 5 মিনিটের বিকৃতকরণের পরামর্শ দেওয়া হয়।
2) অ্যানিলিং ধাপটি সাধারণত 15-60 সেকেন্ড হয়।অ্যানিলিং তাপমাত্রা প্রাইমার জোড়ার Tm উপর ভিত্তি করে এবং সাধারণত 45-68℃ হয়।
