এন্ডোফ্রি প্লাজমিড ম্যাক্সি কিট
এই কিটটি 150 - 300 মিলি ব্যাকটেরিয়াল দ্রবণ রাতারাতি কালচার করা থেকে নিষ্কাশনের জন্য উপযুক্ত, ব্যাকটেরিয়া লাইজ করার জন্য একটি উন্নত SDS-ক্ষারীয় লাইসিস পদ্ধতি ব্যবহার করে।অপরিশোধিত নির্যাসটি বেছে বেছে একটি অনন্য এন্ডোটক্সিন স্ক্যাভেঞ্জারের সাথে মিলিত হয় এবং এন্ডোটক্সিন অপসারণের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা পৃথক করা হয়।তারপরে, সিলিকা জেল ঝিল্লি উচ্চ-লবণ এবং কম-পিএইচ-এর অবস্থার অধীনে দ্রবণে প্লাজমিড ডিএনএর সাথে বেছে বেছে আবদ্ধ হয়।এর পরে অমেধ্য এবং অন্যান্য ব্যাকটেরিয়া উপাদান অপসারণের জন্য ওয়াশ বাফার যুক্ত করা হয়।অবশেষে, সিলিকন ম্যাট্রিক্স মেমব্রেন থেকে বিশুদ্ধ প্লাজমিড ডিএনএ নির্গত করতে একটি কম লবণ, উচ্চ-পিএইচ ইলিউশন বাফার ব্যবহার করা হয়।সিলিকা জেল ঝিল্লি বিশেষ শোষণ ঝিল্লি নিযুক্ত করে এবং কলাম এবং কলামের মধ্যে শোষণের পরিমাণের পার্থক্য খুব কম এবং পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা ভাল।ফেনল, ক্লোরোফর্ম এবং অন্যান্য বিষাক্ত বিকারকগুলির প্রয়োজন নেই এবং ইথানল বৃষ্টিপাতের পদক্ষেপও নেই।এই কিটটি 80% -90% এর নিষ্কাশন হার সহ 0.2 -1.5 মিলিগ্রাম খাঁটি উচ্চ-কপি প্লাজমিড ডিএনএ দ্রুত নিষ্কাশন করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।কিটটি একটি অনন্য প্রক্রিয়া সূত্র ব্যবহার করে এন্ডোটক্সিন অপসারণ করে, এন্ডোটক্সিনের বিষয়বস্তু অত্যন্ত কম এবং কোষ স্থানান্তর প্রভাব চমৎকার।নিষ্কাশিত প্লাজমিড সরাসরি এনজাইম হজম, পিসিআর, ভিট্রো ট্রান্সক্রিপশন, রূপান্তর, সিকোয়েন্সিং এবং অন্যান্য আণবিক জীববিজ্ঞান পরীক্ষায় ব্যবহার করা যেতে পারে।
জমা শর্ত
RNaseA -30 ~ -15℃ এ সংরক্ষণ করা উচিত এবং ≤0℃ এ পরিবহন করা উচিত।
এন্ডোটক্সিন স্ক্যাভেঞ্জার এক মাসের জন্য 2 ~ 8 ℃ তে সংরক্ষণ করা যেতে পারে, দীর্ঘমেয়াদী স্টোরেজের জন্য -30 ~ -15 ℃ এ সংরক্ষণ করা যেতে পারেএবং ≤0℃ এ পরিবহন করা হয়।
অন্যান্য উপাদানগুলি ঘরের তাপমাত্রায় (15 ~ 25 ℃) সংরক্ষণ করা উচিত এবং ঘরের তাপমাত্রায় পরিবহন করা উচিত।
উপাদান
| উপাদান | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| বাফার P1 | 75 মিলি |
| বাফার P2 | 75 মিলি |
| বাফার P4 | 75 মিলি |
| এন্ডোটক্সিন স্ক্যাভেঞ্জার | 25 মিলি |
| বাফার PW | 2 × 22 মিলি |
| বাফার টিবি | 20 মিলি |
| ফাস্টপিউর ডিএনএ ম্যাক্সি কলাম (প্রতিটি 50 মিলি কালেকশন টিউবে) | 10 |
| এন্ডোটক্সিন মুক্ত কালেকশন টিউব | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA অপসারণ করতে ব্যবহৃত হয়।
বাফার P1:ব্যাকটেরিয়াল সাসপেনশন বাফার, প্রথম ব্যবহারের আগে বাফার P1 এ RNaseA যোগ করুন।
বাফার P2:ব্যাকটেরিয়া লাইসিস বাফার (এসডিএস/NaOH সমন্বিত)।
বাফার P4:নিরপেক্ষ বাফার
এন্ডোটক্সিন স্ক্যাভেঞ্জার:অশোধিত প্লাজমিড নির্যাস থেকে কার্যকরভাবে এন্ডোটক্সিন অপসারণ করে।
বাফার PW:বাফার ধুয়ে ফেলুন, প্রথম ব্যবহারের আগে ইথানলের নির্দিষ্ট পরিমাণ যোগ করুন।
বাফার টিবি:ইলুশন বাফার।
ফাস্ট পিউর ডিএনএ ম্যাক্সি কলাম:প্লাজমিড ডিএনএ শোষণ কলাম।
সংগ্রহ টিউব 50 মিলি:পরিস্রাবণ সংগ্রহ টিউব.
এন্ডোটক্সিন মুক্ত সংগ্রহ টিউব:প্লাজমিড ডিএনএ সংগ্রহের টিউব।
প্রস্তুত উপকরণ
পরম ইথানল, আইসোপ্রোপ্যানল, 50 মিলি গোলাকার-নিচের সেন্ট্রিফিউজ টিউব এবং 50 মিলি এন্ডোটক্সিন-মুক্তসেন্ট্রিফিউজ টিউব।
অ্যাপ্লিকেশন
এই পণ্যটি 150 - 300 মিলি ব্যাকটেরিয়াল দ্রবণ থেকে প্লাজমিডের বড় আকারের নিষ্কাশনের জন্য উপযুক্তরাতারাতি সংস্কৃতিবান।
পরীক্ষা প্রক্রিয়া
1. 150 - 200 মিলি (300 মিলি এর বেশি নয়) ব্যাকটেরিয়াল দ্রবণ রাতারাতি কালচার করুন এবং সেন্ট্রিফিউজ করুন1 - 2 মিনিটের জন্য প্রায় 11,000 rpm (12,000 × g)।সুপারনাট্যান্ট বাদ দিন এবং ব্যাকটেরিয়া সংগ্রহ করুন।
Δ 50 মিলিলিটারের বেশি ব্যাকটেরিয়া দ্রবণ সংগ্রহ করার সময়, একই 50 মিলি নলটিতে ব্যাকটেরিয়া দ্রবণ, সেন্ট্রিফিউগেশন, সুপারনাট্যান্ট বাদ দিয়ে এবং অন্যান্য ধাপ যোগ করে ব্যাকটেরিয়া সংগ্রহ করা যেতে পারে।
একাধিক বার.
2. সেন্ট্রিফিউজে 7.5 মিলি বাফার P1 যোগ করুন (দয়া করে পরীক্ষা করুন RNaseA বাফার P1 এ যোগ করা হয়েছে কিনা)ব্যাকটেরিয়াযুক্ত টিউব এবং ঘূর্ণি বা পাইপটিং দ্বারা পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করুন।
Δ এই ধাপে ব্যাকটেরিয়ার সম্পূর্ণ পুনরুদ্ধার ফলনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ, এবং পুনরুদ্ধারের পরে কোনও ব্যাকটেরিয়া ক্লম্প থাকা উচিত নয়।যদি ব্যাকটেরিয়াল ক্লাম্প থাকে যা পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত না হয় তবে এটি লাইসিসকে প্রভাবিত করবে, ফলন কম এবং বিশুদ্ধতা হবে।ব্যাকটেরিয়া দ্রবণের OD600 0.65 হলে, 150 মিলি ব্যাকটেরিয়াল দ্রবণ থেকে বের করার সময় 7.5 মিলি বাফার পি1 ব্যবহার করার পরামর্শ দেওয়া হয়;যখন OD600 0.75 হয়, তখন 8 মিলি বাফার P1 ব্যবহার করা উচিত এবং বাফার P2 এবং P4 এর ভলিউম সেই অনুযায়ী পরিবর্তন করা উচিত।যদি ব্যাকটেরিয়া দ্রবণের পরিমাণ 200 মিলি বাড়ানো হয়, তবে এটি সুপারিশ করা হয় যেবাফার P1, P2, এবং P4 এর ভলিউম আনুপাতিকভাবে বৃদ্ধি করা হবে।
3. ধাপ 2 থেকে ব্যাকটেরিয়াল সাসপেনশনে 7.5 মিলি বাফার P2 যোগ করুন এবং 6 - 8 পর্যন্ত আলতোভাবে মেশানবার এবং কক্ষ তাপমাত্রায় 4 - 5 মিনিটের জন্য incubate.
Δ পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মেশানোর জন্য আলতো করে উল্টে দিন।ঘূর্ণিকরণ জিনোমিক ডিএনএ ফ্র্যাগমেন্টেশন ঘটাবে, যার ফলে নিষ্কাশিত প্লাজমিডে জিনোমিক ডিএনএ খণ্ডিত হবে।এই সময়ে, দ্রবণটি সান্দ্র এবং স্বচ্ছ হয়ে যায়, যা দেখায় যে ব্যাকটেরিয়া সম্পূর্ণরূপে লাইসড হয়েছে।প্লাজমিডের ধ্বংস এড়াতে সময়কাল 5 মিনিটের বেশি হওয়া উচিত নয়।সমাধান পরিষ্কার না হলে, অনেক ব্যাকটেরিয়া হতে পারেঅসম্পূর্ণ lysis, তাই ব্যাকটেরিয়ার পরিমাণ যথাযথভাবে হ্রাস করা উচিত।
4. ধাপ 3 থেকে ব্যাকটেরিয়াল সাসপেনশনে 7.5 মিলি বাফার P4 যোগ করুন এবং দ্রবণটিকে সম্পূর্ণরূপে বাফার P2 নিরপেক্ষ করার অনুমতি দেওয়ার জন্য আলতোভাবে 6 - 8 বার উল্টে দিন।এই সময়ে, সাদা flocculent অবক্ষেপ প্রদর্শিত হবে।10 - 15 মিনিটের জন্য প্রায় 11,000 rpm (12,000 × g) এর বেশি সেন্ট্রিফিউজ করুন, সাবধানে সুপারনাট্যান্টটিকে একটি নতুন 50 মিলি গোলাকার নীচের সেন্ট্রিফিউজ টিউবে (স্ব-প্রস্তুত) পিপেট করুন এবং এড়িয়ে চলুনভাসমান সাদা অবক্ষয় অ্যাসপিরেট করুন।
Δ বাফার P4 যোগ করুন এবং অবিলম্বে ভালভাবে মিশ্রিত করতে বিপরীত করুন।নিরপেক্ষকরণকে প্রভাবিত করতে পারে এমন স্থানীয় বৃষ্টিপাতের উত্পাদন রোধ করতে দ্রবণ জুড়ে সাদা বর্ষণ সমানভাবে বিতরণ না হওয়া পর্যন্ত টিউবটিকে দাঁড়াতে দিন।সেন্ট্রিফিউগেশনের আগে যদি অভিন্ন সাদা ফ্লোকুলেন্ট অবক্ষেপ না থাকে এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে সুপারনাট্যান্ট পরিষ্কার না হয়, তাহলে টিউব হতে পারেআরও 5 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছে।
5. এন্ডোটক্সিন স্ক্যাভেঞ্জারের আয়তনের 0. 1 গুণ (সুপারনেট্যান্ট আয়তনের 10%, প্রায় 2.2 মিলি) ধাপ 4 থেকে সুপারনাট্যান্টে যোগ করুন এবং মিশ্রিত করার জন্য উল্টে দিন।দ্রবণটিকে একটি বরফের স্নানে রাখুন বা 5 মিনিটের জন্য গুঁড়ো বরফের (বা রেফ্রিজারেটর ফ্রিজার) মধ্যে ঢোকান যতক্ষণ না দ্রবণটি নোংরা থেকে পরিষ্কার এবং স্বচ্ছ (বা এখনও) হয়ে যায়সামান্য অগোছালো), এবং মাঝে মাঝে কয়েকবার মিশ্রিত করুন।
Δ এন্ডোটক্সিন স্ক্যাভেঞ্জার সুপারন্যাট্যান্টের সাথে যোগ করার পরে, সুপারনাট্যান্টটি টর্বিড হয়ে যাবে কিন্তুবরফের স্নানে ঠাণ্ডা হওয়ার পরে সুপারন্যাট্যান্ট পরিষ্কার (বা সামান্য ঘোলা) হওয়া উচিত।
6. সুপারনাট্যান্টকে 10 - 15 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় (>25℃) রাখার পরে, এটি নোংরা হয়ে যাবেএর তাপমাত্রা ঘরের তাপমাত্রায় বৃদ্ধি পায়।তারপর সুপারনট্যান্টকে মেশানোর জন্য উল্টাতে হবে।
Δ যদি ঘরের তাপমাত্রা কম হয় বা আপনি নিষ্কাশনের সময় কমাতে চান, তাহলে সুপারনাট্যান্টকে 37 ~ 42 ℃ জলের স্নানে 5 - 10 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা যেতে পারে এবং সুপারন্যাট্যান্টের পরে পরবর্তী পদক্ষেপটি করা যেতে পারে।ঘোলা হয়ে যায়।
7. ফেজটি আলাদা করতে ঘরের তাপমাত্রায় (তাপমাত্রা অবশ্যই 25℃ হতে হবে) 10 মিনিটের জন্য প্রায় 11,000 rpm (12,000 × g) এ সুপারনাট্যান্টকে সেন্ট্রিফিউজ করুন।উপরের জলীয় স্তরে ডিএনএ থাকে যখন নীচের নীল তৈলাক্ত স্তরে এন্ডোটক্সিন এবং অন্যান্য অমেধ্য থাকে।স্থানান্তরডিএনএ-ধারণ করে একটি নতুন টিউবের জলীয় পর্যায় এবংতৈলাক্ত স্তর ফেলে দিন।
Δ সেন্ট্রিফিউগেশনের সময় তাপমাত্রা অবশ্যই 25 ℃ এর বেশি হতে হবে কারণ কার্যকর ফেজ বিচ্ছেদ হয় নাতাপমাত্রা খুব কম হলে ঘটবে।
Δ যদি ফেজ বিচ্ছেদ কার্যকর না হয়, সেন্ট্রিফিউগেশন তাপমাত্রা 30℃ এ সামঞ্জস্য করা যেতে পারে এবংসেন্ট্রিফিউগেশনের সময় 15 মিনিটে বাড়ানো যেতে পারে।
Δ নীল তৈলাক্ত স্তরটি চুষবেন না কারণ এতে এন্ডোটক্সিন এবং অন্যান্য অমেধ্য রয়েছে।
পদ্ধতি
রিসাসপেনশন লাইসিস নিরপেক্ষকরণ
◇ 7.5 মিলি বাফার P1 যোগ করুন
◇ 7.5 মিলি বাফার P2 যোগ করুন
◇ 7.5 মিলি বাফার P4 যোগ করুন
এন্ডোটক্সিন অপসারণ
◇ এন্ডোটক্সিন স্ক্যাভেঞ্জারের সুপারনাট্যান্ট আয়তনের 0. 1 গুণ যোগ করুন
বাঁধাই এবং ওয়াশিং
◇ আইসোপ্রোপ্যানলের আয়তনের 0.5 গুণ যোগ করুন
◇ 10 মিলি বাফার PW যোগ করুন
◇ 10 মিলি বাফার PW যোগ করুন
ইলুশন
◇ 1 - 2 মিলি বাফার টিবি বা এন্ডোটক্সিন-মুক্ত ddH2O যোগ করুন
