ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইম
ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইমটি একটি রিকম্বিন্যান্ট ই কোলাই স্ট্রেন থেকে উদ্ভূত হয় যা ভ্যাক্সিনিয়া ক্যাপিং এনজাইমের জিন বহন করে।এই একক এনজাইম দুটি সাবইউনিট (D1 এবং D12) দ্বারা গঠিত এবং এর তিনটি এনজাইম্যাটিক ক্রিয়াকলাপ রয়েছে (D1 সাবইউনিটের দ্বারা RNA ট্রাইফসফেটেস এবং গুয়ানিলাইলট্রান্সফেরেজ এবং D12 সাবইউনিট দ্বারা গুয়ানিন মিথাইলট্রান্সফেরেজ)।ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইম ক্যাপ গঠনের অনুঘটক করতে কার্যকর, যা বিশেষভাবে RNA-এর 5′ প্রান্তে 7-মিথাইলগুয়ানিলেট ক্যাপ স্ট্রাকচার (m7Gppp, Cap 0) সংযুক্ত করতে পারে।ক্যাপ গঠন (ক্যাপ 0) ইউক্যারিওটে এমআরএনএ স্থিতিশীলতা, পরিবহন এবং অনুবাদে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে।এনজাইম্যাটিক বিক্রিয়া দ্বারা RNA ক্যাপিং একটি কার্যকর এবং সহজ পদ্ধতি যা ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রিপশন, ট্রান্সফেকশন এবং মাইক্রোইনজেকশনের জন্য RNA-এর স্থায়িত্ব এবং অনুবাদকে উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করতে পারে।
উপাদান
ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইম (10 U/μL)
10×ক্যাপিং বাফার
জমা শর্ত
-25～- 15℃ স্টোরেজের জন্য （পুনরাবৃত্ত ফ্রিজ-থাও চক্র এড়িয়ে চলুন）
স্টোরেজ বাফার
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% গ্লিসারল।
ইউনিট সংজ্ঞা
ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইমের এক ইউনিটকে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার মধ্যে একটি 80nt ট্রান্সক্রিপ্টে GTP-এর 10pmol অন্তর্ভুক্ত করার জন্য প্রয়োজনীয় এনজাইমের পরিমাণ হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়।
মান নিয়ন্ত্রণ
Exonuclease:ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইমের 10U 1μg λ-Hind III ডাইজেস্ট ডিএনএ 37 ℃ তে 16 ঘন্টা ধরে রাখলে অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত কোনও অবনতি হয় না।
এন্ডোনিউক্লিজ:ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইমের 10U এর 1μg λDNA সহ 37℃ তে 16 ঘন্টার জন্য অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত কোনও অবনতি হয় না।
নিকাসে:ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইমের 10U 1 μg pBR322 এর সাথে 37 ℃ তে 16 ঘন্টার জন্য অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত কোনও অবনতি হয় না।
RNase:ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইমের 10U 1.6μg MS2 RNA সহ 37℃ তাপমাত্রায় 4 ঘন্টার জন্য অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত কোনও অবনতি হয় না।
1.কোলাই ডিএনএ:ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইমের 10U E. coli 16S rRNA লোকাসের জন্য নির্দিষ্ট প্রাইমার সহ TaqMan qPCR ব্যবহার করে E. coli জিনোমিক DNA এর উপস্থিতির জন্য স্ক্রীন করা হয়।ই. কোলাই জিনোমিক ডিএনএ দূষণ হল≤1 ই. কোলাই জিনোম।
2.ব্যাকটেরিয়াল এন্ডোটক্সিন: LAL-পরীক্ষা, চাইনিজ ফার্মাকোপিয়া IV 2020 সংস্করণ অনুযায়ী, জেল সীমা পরীক্ষার পদ্ধতি, সাধারণ নিয়ম (1143)।ব্যাকটেরিয়াল এন্ডোটক্সিন কন্টেন্ট ≤10 EU/mg হওয়া উচিত।
প্রতিক্রিয়া সিস্টেম এবং শর্তাবলী
1. ক্যাপিং প্রোটোকল (প্রতিক্রিয়ার পরিমাণ: 20 μL)
এই পদ্ধতিটি 10μg RNA (≥100 nt) এর ক্যাপিং প্রতিক্রিয়ার ক্ষেত্রে প্রযোজ্য এবং এটি পরীক্ষামূলক চাহিদা অনুযায়ী স্কেল করা যেতে পারে।
I) একটি 1.5 মিলি মাইক্রোফিউজ টিউবে 10μg RNA এবং নিউক্লিজ-মুক্ত H2O কে 15.0 μL এর চূড়ান্ত আয়তনে একত্রিত করুন।*10×ক্যাপিং বাফার: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) 5 মিনিটের জন্য 65℃ এ তাপ করুন এবং তারপরে 5 মিনিটের জন্য বরফ স্নান করুন।
3) নির্দিষ্ট ক্রমে নিম্নলিখিত উপাদান যোগ করুন
| Cসমর্থক | Vঅলুম |
| বিকৃত RNA (≤10μg, length≥100 nt) | 15 μL |
| 10×ক্যাপিং বাফার* | 2 μL |
| GTP (10 মিমি) | 1 μL |
| SAM (2 মিমি) | 1 μL |
| ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইম (10U/μL) | 1 μL |
*10×ক্যাপিং বাফার: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)
4) 37°C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন, আরএনএ এখন সীমাবদ্ধ এবং ডাউনস্ট্রিম অ্যাপ্লিকেশনের জন্য প্রস্তুত।
2. 5′ টার্মিনাল লেবেলিং প্রতিক্রিয়া (প্রতিক্রিয়ার পরিমাণ: 20 μL)
এই প্রোটোকলটি একটি 5´ ট্রাইফসফেট ধারণকারী RNA লেবেল করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে এবং এটি চাহিদা অনুযায়ী স্কেল করা যেতে পারে।লেবেল সংযোজনের দক্ষতা RNA: GTP, সেইসাথে RNA নমুনার GTP বিষয়বস্তুর মোলার অনুপাত দ্বারা প্রভাবিত হবে।
1) একটি 1.5 মিলি মাইক্রোফিউজ টিউবে 14.0 μL এর চূড়ান্ত আয়তনে উপযুক্ত পরিমাণ RNA এবং নিউক্লিজ-মুক্ত H2O একত্রিত করুন।
2) 5 মিনিটের জন্য 65℃ এ তাপ করুন এবং তারপরে 5 মিনিটের জন্য বরফ স্নান করুন।
3) নির্দিষ্ট ক্রমে নিম্নলিখিত উপাদান যোগ করুন.
| Cসমর্থক | Vঅলুম |
| বিকৃত আরএনএ | 14 μL |
| 10×ক্যাপিং বাফার | 2 μL |
| GTP মিশ্রণ** | 2 μL |
| SAM (2 মিমি) | 1 μL |
| ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস ক্যাপিং এনজাইম (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX বলতে GTP এবং অল্প সংখ্যক মার্কার বোঝায়।GTP এর ঘনত্বের জন্য, পড়ুননোট 3.
4) 30 মিনিটের জন্য 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউবেট করুন, আরএনএ 5′ শেষ এখন লেবেলযুক্ত এবং ডাউনস্ট্রিমের জন্য প্রস্তুত
অ্যাপ্লিকেশন
1. ট্রান্সলেশন অ্যাসেস/ইন ভিট্রো ট্রান্সলেশনের আগে mRNA ক্যাপিং
2. mRNA এর 5´ শেষে লেবেল করা
ব্যবহারের নোট
1.ভ্যাক্সিনিয়া ক্যাপিং এনজাইম দিয়ে ইনকিউবেশনের আগে RNA-এর দ্রবণকে গরম করা ট্রান্সক্রিপ্টের 5´প্রান্তে গৌণ কাঠামো সরিয়ে দেয়।পরিচিত উচ্চ কাঠামোগত 5´এন্ড সহ ট্রান্সক্রিপ্টের জন্য সময় বাড়ান 60 মিনিট।
2. ক্যাপিং প্রতিক্রিয়ার জন্য ব্যবহৃত RNA ব্যবহার করার আগে বিশুদ্ধ করা উচিত এবং নিউক্লিজ-মুক্ত জলে ঝুলিয়ে রাখা উচিত।EDTA উপস্থিত থাকা উচিত নয় এবং সমাধানটি লবণ মুক্ত হওয়া উচিত।
3. 5´ প্রান্ত লেবেল করার জন্য, মোট GTP ঘনত্ব প্রতিক্রিয়ায় mRNA এর মোলার ঘনত্বের প্রায় 1-3 গুণ হওয়া উচিত।
4. প্রতিক্রিয়া সিস্টেমের আয়তন প্রকৃত অনুযায়ী উপরে বা নিচে স্কেল করা যেতে পারে।
