PNGase F
পেপটাইড-এন-গ্লাইকোসিডেস F(PNGase F) হল গ্লাইকোপ্রোটিন থেকে প্রায় সমস্ত এন-লিঙ্কযুক্ত অলিগোস্যাকারাইড অপসারণের জন্য সবচেয়ে কার্যকর এনজাইমেটিক পদ্ধতি।PNGase F হল একটি অ্যামিডেস, যা এন-লিঙ্কযুক্ত গ্লাইকোপ্রোটিন থেকে উচ্চ ম্যাননোজ, হাইব্রিড এবং জটিল অলিগোস্যাকারাইডের অভ্যন্তরীণ সর্বাধিক GlcNAc এবং অ্যাসপারাজিন অবশিষ্টাংশগুলির মধ্যে বিভক্ত।
আবেদন
এই এনজাইম প্রোটিন থেকে কার্বোহাইড্রেটের অবশিষ্টাংশ অপসারণের জন্য দরকারী।
প্রস্তুতি এবং স্পেসিফিকেশন
| চেহারা | বর্ণহীন তরল |
| প্রোটিন বিশুদ্ধতা | ≥95% (এসডিএস-পৃষ্ঠা থেকে) |
| কার্যকলাপ | ≥500,000 U/mL |
| এক্সোগ্লাইকোসিডেস | কোন কার্যকলাপ সনাক্ত করা যায়নি (ND) |
| এন্ডোগ্লাইকোসিডেস F1 | ND |
| এন্ডোগ্লাইকোসিডেস F2 | ND |
| এন্ডোগ্লাইকোসিডেস F3 | ND |
| এন্ডোগ্লাইকোসিডেস এইচ | ND |
| প্রোটিজ | ND |
বৈশিষ্ট্য
| ইসি নম্বর | 3.5.1.52(অণুজীব থেকে রিকম্বিন্যান্ট) |
| আণবিক ভর | 35 kDa (SDS-পৃষ্ঠা) |
| সমবৈদ্দুতিক বিন্দু | 8. 14 |
| সর্বোত্তম পিএইচ | 7.0-8.0 |
| সর্বোত্তম তাপমাত্রা | 65 °সে |
| সাবস্ট্রেটের নির্দিষ্টতা | GlcNAc এবং অ্যাসপারাজিন অবশিষ্টাংশের মধ্যে গ্লাইকোসিডিক বন্ধন ক্লিভিং চিত্র.1 |
| স্বীকৃতি সাইট | α1-3 ফুকোজ ধারণ না করলে এন-লিঙ্কড গ্লাইক্যানস চিত্র 2 |
| অ্যাক্টিভেটর | ডিটিটি |
| ইনহিবিটার | এসডিএস |
| সংগ্রহস্থল তাপমাত্রা | -25 ~-15 ℃ |
| তাপ নিষ্ক্রিয়করণ | 1µL PNGase F ধারণকারী একটি 20µL বিক্রিয়া মিশ্রণ 75 °C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য ইনকিউবেশনের মাধ্যমে নিষ্ক্রিয় হয়। |
চিত্র 1 PNGase F এর সাবস্ট্রেটের নির্দিষ্টতা
চিত্র 2 PNGase F এর স্বীকৃতি
যখন অভ্যন্তরীণ GlcNAc অবশিষ্টাংশগুলি α1-3 ফুকোসের সাথে সংযুক্ত থাকে, তখন PNGase F গ্লাইকোপ্রোটিন থেকে N-লিঙ্কযুক্ত অলিগোস্যাকারাইডগুলিকে বিচ্ছিন্ন করতে পারে না।এই পরিবর্তন গাছপালা এবং কিছু পোকা গ্লাইকোপ্রোটিনে সাধারণ।
Cউপাদান
|
| উপাদান | একাগ্রতা |
| 1 | PNGase F | 50 μl |
| 2 | 10×গ্লাইকোপ্রোটিন ডিনাচারিং বাফার | 1000 μl |
| 3 | 10×গ্লাইকোবাফার 2 | 1000 μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 μl |
ইউনিট সংজ্ঞা
10 μL এর মোট বিক্রিয়া আয়তনে 37°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার মধ্যে 10 µg বিকৃত RNase B থেকে কার্বোহাইড্রেটের 95% কার্বোহাইড্রেট অপসারণের জন্য প্রয়োজনীয় এনজাইমের পরিমাণ হিসাবে এক ইউনিট(U) সংজ্ঞায়িত করা হয়।
প্রতিক্রিয়া শর্ত
1. ডিওনাইজড জলে 1-20 μg গ্লাইকোপ্রোটিন দ্রবীভূত করুন, 1 μl 10×গ্লাইকোপ্রোটিন ডিনেচারিং বাফার এবং H2O (যদি প্রয়োজন হয়) যোগ করুন একটি 10 μl মোট প্রতিক্রিয়া আয়তন তৈরি করুন।
2.10 মিনিটের জন্য 100 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে সেঁকুন, বরফে ঠান্ডা করুন।
3.2 μl 10×GlycoBuffer 2, 2 μl 10% NP-40 যোগ করুন এবং মিশ্রিত করুন।
4.1-2 μl PNGase F এবং H যোগ করুন2O (যদি প্রয়োজন হয়) একটি 20 μl মোট প্রতিক্রিয়া ভলিউম এবং মিশ্রণ করতে।
5.60 মিনিটের জন্য 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় প্রতিক্রিয়া সেবন করুন।
6.SDS-PAGE বিশ্লেষণ বা HPLC বিশ্লেষণের জন্য।
