mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase একটি রিকম্বিন্যান্ট E. coli স্ট্রেন থেকে উদ্ভূত হয়েছিল যা mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase ভ্যাক্সিনিয়ার জিন বহন করে।এই এনজাইমটি আরএনএ-র 5´প্রান্তে ক্যাপ গঠনের সংলগ্ন প্রথম নিউক্লিওটাইডের 2´-O অবস্থানে একটি মিথাইল গ্রুপ যোগ করে। এনজাইমটি মিথাইল ক্যাপড আরএনএ (ক্যাপড) তে মিথাইল দাতা হিসেবে এস-এডেনোসিলমেথিওনিন (এসএএম) ব্যবহার করে। -0) একটি ক্যাপ- 1 কাঠামোর ফলে।

Cap1 কাঠামো অনুবাদের দক্ষতা বাড়াতে পারে, ট্রান্সফেকশন এবং মাইক্রোইনজেকশন পরীক্ষায় mRNA এর অভিব্যক্তিকে উন্নত করতে পারে। এই এনজাইমের জন্য বিশেষভাবে সাবস্ট্রেট হিসাবে m7GpppN ক্যাপ সহ RNA প্রয়োজন।এটি 5´ শেষে pN, ppN, pppN বা GpppN এর সাথে RNA ব্যবহার করতে পারে না।ক্যাপড আরএনএ ক্যাপ অ্যানালগ ব্যবহার করে ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রিপশনের মাধ্যমে বা ভ্যাক্সিনিয়া ক্যাপিং এনজাইম ব্যবহার করে এনজাইমেটিক ক্যাপিংয়ের মাধ্যমে প্রস্তুত করা যেতে পারে।

উপাদান

mRNA ক্যাপ 2´-ও-মিথাইলট্রান্সফেরেজ (50U/μL)

10×ক্যাপিং রিঅ্যাকশন বাফার

স্টোরেজ

স্টোরেজের জন্য -25 ～- 15℃ （পুনরাবৃত্ত ফ্রিজ-থাও চক্র এড়িয়ে চলুন）

স্টোরেজ বাফার

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100，50% গ্লিসারল।

ইউনিট সংজ্ঞা

একটি ইউনিটকে 37°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার মধ্যে 80 nt ক্যাপড RNA ট্রান্সক্রিপ্টের 10 pmoles মিথিলেট করার জন্য প্রয়োজনীয় এনজাইমের পরিমাণ হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়।

মান নিয়ন্ত্রণ assays

Exonuclease1μg λ-হিন্দ III ডাইজেস্ট ডিএনএ সহ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase এর 50U 37 ℃ তে 16 ঘন্টার জন্য অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত কোনও অবনতি হয় না।

এন্ডোনিউক্লিজ: 50 U এর mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase এর সাথে 1 μg λDNA 37℃ এ 16 ঘন্টার জন্য অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত কোন অবনতি হয় না।

নিকসে: 50U এর mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase এর সাথে 1μg pBR322 37 ℃ তে 16 ঘন্টার জন্য অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত কোনও অবনতি হয় না।

RNase: 50U এর mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase-এর সাথে 1.6μg MS2 RNA 4 ঘন্টার জন্য 37℃ এ অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নির্ধারিত কোন অবনতি হয় না।

E. কোলি ডিএনএ: mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase এর 50U উপস্থিতির জন্য স্ক্রীন করা হয়E. কোলি এর জন্য নির্দিষ্ট প্রাইমার সহ TaqMan qPCR ব্যবহার করে জিনোমিক ডিএনএE. কোলি 16S rRNA লোকাস।দ্যE. কোলি জিনোমিক ডিএনএ দূষণ =1E. কোলি জিনোম

ব্যাকটেরিয়াল এন্ডোটক্সিন: LAL-পরীক্ষা, চাইনিজ ফার্মাকোপিয়া IV 2020 সংস্করণ অনুযায়ী, জেল সীমা পরীক্ষার পদ্ধতি, সাধারণ নিয়ম (1143)।ব্যাকটেরিয়াল এন্ডোটক্সিন কন্টেন্ট = 10 EU/mg হওয়া উচিত।

প্রতিক্রিয়া সিস্টেম এবং শর্তাবলী

1. একটি 1.5 মিলি মাইক্রোফিউজ টিউবে 16.0 μL এর চূড়ান্ত আয়তনে উপযুক্ত পরিমাণে ক্যাপড RNA এবং RNase-মুক্ত H2O একত্রিত করুন।

2. 5 মিনিটের জন্য 65℃ এ তাপ করুন এবং 5 মিনিটের জন্য একটি বরফ-স্নান করুন৷

3. নিম্নলিখিত উপাদানগুলিকে নির্দিষ্ট ক্রমে যুক্ত করুন (ক্যাপড আরএনএ-এর মিথাইলেশনের জন্য

10 এর কম

*10× ক্যাপিং রিঅ্যাকশন বাফার : 500 মিমি ট্রিস-এইচসিএল (পিএইচ 8.0, 25℃), 50 মিমি কেসিএল, 10 মিমি এমজিসিএল2 , 10 মিমি ডিটিটি।

4. 37℃ তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করুন (200 nt এর কম টার্গেট ফ্র্যাগমেন্টের জন্য 2 ঘন্টা ইনকিউবেশন বাঞ্ছনীয়)।

অ্যাপ্লিকেশন

মাইক্রোইনজেকশন এবং ট্রান্সফেকশন পরীক্ষার সময় এমআরএনএ এক্সপ্রেশন উন্নত করতে।

ব্যবহারের নোট

1. প্রতিক্রিয়ার আগে, আরএনএ শুদ্ধ করা উচিত এবং নিউক্লিজ-মুক্ত জলে দ্রবীভূত করা উচিত, সমস্ত দ্রবণে কোনও EDTA এবং আয়ন থাকা উচিত নয়।

2. ট্রান্সক্রিপ্টের 5'প্রান্তে গৌণ কাঠামো অপসারণের জন্য প্রতিক্রিয়ার 5 মিনিট আগে নমুনা RNA 65℃-এ গরম করার পরামর্শ দেওয়া হয়।জটিল 5 ´ -টার্মিনাল কাঠামোর জন্য এটি 10 ​​মিনিট পর্যন্ত বাড়ানো যেতে পারে।